MICROPROPAGARE IN VITRO

[ Facebook comments]

Despre Planta Goji - Cercetari documentate in cadrul acesta









.

Moderator: bernard

MICROPROPAGARE IN VITRO

PostAuthor: bernard » Wed Mar 26, 2014 8:36 pm

Biolog Alexandru FIRA

parti din rezumatul tezei de doctorat

OPTIMIZAREA TEHNICILOR DE MICROPROPAGARE IN VITRO A UNOR SOIURI DE ARBUSTI FRUCTIFERI SI ORNAMENTALI

...

INTRODUCERE

Biotehnologiile vegetale reprezintă una din principalele realizări ale ştiinţei şi tehnicii secolului XX, cu un rol deosebit în dezvoltarea agriculturii şi horticulturii moderne.

Micropropagarea in vitro este ramura biotehnologiei vegetale care reprezintă un ansamblu de metode de înmulţire a plantelor prin utilizarea culturilor in vitro de celule, ţesuturi şi organe vegetale. Utilizarea acestei tehnici permite sporirea considerabilă a randamentului la înmulţire a diferitelor specii, fiind totodată şi o metodă de eliberare de agenţii patogeni din materialul săditor.

Micropropagarea este un instrument cu un potenţial imens pentru conservarea biodiversităţii, prin utilizarea culturilor in vitro se pot înmulţi multe specii rare, protejate, de exemplu specii endemice de Dianthus (Cristea, 2010) şi, de asemenea, specii şi soiuri de plante
de cultură care sunt puţin utilizate şi se află pe cale de dispariţie. Micropropagarea are o deosebită importanţă în domeniul ameliorării plantelor, culturile in vitro sunt indispensabile pentru domeniul ingineriei genetice vegetale.

Dezvoltarea unor protocoale eficiente de înmulţire prin culturi in vitro a speciilor pomicole, mai ales a celor cu dificultăţi la înmulţirea clasică, pot sprijini dezvoltarea industriei pepinieristice în România pentru a produce material săditor la standarde europene, în contextul necesităţii reconversiei în plantaţiile pomicole.

Cultivarea pe scară mai largă a arbuştilor fructiferi şi mai ales a speciilor mai puţin cultivate abordate în cadrul acestei lucrări şi anume: Amelanchier canadensis – Fam. Rosaceae , Lonicera kamtschatica – Fam. Caprifoliaceae, Lycium barbarum – Fam. Solanaceae, Rubus fruticosus – Fam. Rosaceae, Vaccinium macrocarpon – Fam. Ericaceae este motivată în special de importanţa alimentară a acestora, datorată conţinutului mare de vitamine, săruri minerale, antioxidanţi dar şi de rezistenţa unora (amelanchier, goji şi mai ales lonicera) la temperaturi foarte scăzute precum şi capacitatea lor de a valorifica terenuri mai slab productive.

În acest context, teza de doctorat “Optimizarea tehnicilor de micropropagare « in vitro » a unor soiuri de arbuşti fructiferi şi ornamentali” abordează aspecte privind modul în care se pretează la înmulţirea in vitro cele cinci specii de arbuşti fructiferi şi ornamentali, cu scopul de a elabora protocoale eficiente de micropropagare, utile pentru producerea de material săditor.

Elaborarea unor protocoale optime în vederea obţinerii unei eficienţe ridicate la micropropagarea acestor specii, prin stimularea ratei de multiplicare, îmbunătăţirea procesului de rizogeneză in vitro şi/sau ex vitro şi a tehnicilor de aclimatizare concomitent cu menţinerea uniformităţii genetice a plantelor micropropagate, este justificată atât din punct de vedere ştiinţific cât şi din punct de vedere economic.

Din punct de vedere ştiinţific lucrarea aduce date noi în literatura de specialitate prin studiile de micropropagare ale acestor specii. Metodele de aclimatizare aplicate, respectiv aclimatizarea în hidrocultură prin flotaţie (“float hydroponics”) şi aclimatizarea în perlit flotant sunt, de asemnea, un element de noutate şi originalitate în domeniu. Din punct de vedere economic lucrarea furnizează cinci protocoale eficiente care pot fi aplicate cu succes în pepinierele pomicole dotate cu laboratoare de culturi in vitro, în vederea producerii de material săditor containerizat.

I. SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR

Scopul cercetărilor a fost de a elabora protocoale optime în vederea obţinerii unei eficienţe ridicate la micropropagarea unor noi soiuri de arbuşti fructiferi şi ornamentali din genurile Amelanchier, Lonicera, Lycium, Rubus şi Vaccinium, prin stimularea ratei de multiplicare, îmbunătăţirea procesului de rizogeneză in vitro şi/sau ex vitro şi a tehnicilor de aclimatizare concomitent cu menținerea uniformității genetice a plantelor micropropagate.
În acest sens s-a urmărit crearea de tehnologii optimizate de multiplicare in vitro bazate pe metode simple, accesibile, eficiente, utilizate în prezent pe scară largă în domeniul micropropagării, respectiv minibutăşirea in vitro prin utilizarea de fragmente de lăstari cu mai mulţi muguri axilari.

Obiective urmărite

Pentru realizarea scopului propus, prin cercetările întreprinse au fost abordate următoarele obiective:

· stabilirea tipurilor de explante pentru cultura in vitro a speciilor studiate, atît pentru fazele de iniţiere şi multiplicare in vitro cît şi pentru cea de înrădăcinare in vitro;
· stabilirea mediilor bazale şi a diverselor combinaţii de hormoni pentru cultura in vitro a acestor specii pentru etapele de iniţiere, multiplicare şi rizogeneză in vitro;
· testarea unor agenţi de gelificare noi pentru diferitele medii de cultură;
· studiul fazei de rizogeneză ex vitro şi aclimatizare ex vitro în substraturi solide (turbă, perlit etc.);
· testarea tehnicilor de aclimatizare ex vitro în hidrocultură, a metodei “float hydroponics” şi a metodei de înrădăcinare directă ex vitro şi aclimatizare în perlit flotant la speciile luate în studiu;
· elaborarea de protocoale eficiente de micropropagare in vitro pentru cele cinci specii de arbuşti, de care să beneficieze producătorii de material săditor pomicol.

Motivarea alegerii temei de cercetare

Alegerea temei de cercetare Optimizarea tehnicilor de micropropagare in vitro a unor soiuri de arbuşti fructiferi şi ornamentali a fost motivată în primul rând de faptul că micropropagarea speciilor luate în studiu este mai puţin prezentată în literatura de specialitate, speciile fiind, de asemenea, recent introduse în cultură atât la noi în ţară cât şi în unele ţări din Europa.

Aceste specii se remarcă atât prin valoarea lor alimentară datorită conţinutului mare de vitamine, săruri minerale şi antioxidanţi dar şi printr-o rezistenţă ridicată atât la temperaturile scăzute din anotimpurile reci cât şi la cele ridicate din cursul verii, valorificâd, de asemenea, şi solurile mai puţin fertile. Având în vedere faptul că aceste specii sunt mai puţin cultivate în prezent, dificultatea producerii de material săditor poate fi un impediment pentru înfiinţarea de plantaţii comerciale.

În acest context, elaborarea unor protocoale eficiente pentru producerea de material săditor prin micropropagare la aceste specii va permite introducerea rapidă în cultură a soiurilor nou create sau cerute pe piaţă. Pe de altă parte, importanţa ştiinţifică a temei de cercetare abordate constă în dobândirea de noi cunoştinţe morfologice, anatomice, fiziologice referitoare la comportamentul speciilor studiate în cultura in vitro şi în faza de înrădăcinare şi aclimatizare ex vitro.

......

Micropropagarea la Goji (Lycium barbarum) reprezintă o reală provocare pentru că nu s-au găsit în literatura de specialitate lucrări privind multiplicarea in vitro la această specie prin procedee clasice de minibutăşire prin culturi de fragmente de lăstari. Culturile in vitro au fost iniţiate utilizând seminţe. S-a realizat regenerarea de lăstari din explante foliare prin organogeneză directă (Hu şi colab., 2001) şi embriogeneză somatică via
calus pornind de la explante radiculare (Hu şi colab., 2008).

......

2.3.Tehnici speciale utilizate in micropropagare

În acest subcapitol sunt descrise unele tehnici speciale utilizate în micropropagare cum ar fi: utilizarea bioreactoarelor în micropropagare, utilizarea mediilor lichide statice cu sau fără suport mecanic, sterilizarea chimică a mediilor de cultură fără autoclavare şi sterilizarea în cuptorul cu microunde, folosirea unor agenţi de gelificare alternativi, folosirea unor fertilizanţi sintetici ca substituenţi ai mediilor bazale, alte surse de carbon şi energie, posibilităţi de
conservare in vitro, tehnici speciale de aclimatizare sau rolul roboticii în micropropagare. Specialiştii de la CIRAD au pus la punct sistemul RITA (Recipient á Immersion Temporaire Automatique sau “Recipientul cu Imersie Temporară Automată”) un sistem relativ complex alcătuit dintr-un număr variabil de bioreactoare de plastic, vase rigide de mici dimensiuni, conectate prin tuburi la un sistem automat de alimentare cu aer comprimat.

Sistemul SETIS produs în Belgia şi bioreactoarul Plantform se bazează pe utilizarea de flacoane de material plastic de dimensiuni mai mari şi operează după principiul imersiei temporare automate, similar cu sistemul RITA.
Mediile lichide statice au dat rezultate bune la germinaţia seminţelor şi creşterea plantulelor la orhideea Doritaenopsis (Tsai şi Chu, 2008), micropropagarea speciilor Picrorhiza kurroa (Sood şi Chauhan, 2009), Stevia rebaudiana (Kalpana şi colab., 2009).

Teixeira şi colaboratorii (2006) au testat hipocloritul de sodiu ca şi sterilizant pentru mediile nutritive, la Ananas comosus. Mediile cu clor activ de minimum 0,0003 % au dat procent de contaminare zero şi o rată de proliferare optimă, de 13,4, la martorul autoclavat aceasta fiind de doar 6,6. Cardoso şi da Silva (2012) au testat sterilizarea chimică a mediilor nutritive folosind bioxid de clor, la specia Gerbera jamesonii, în faza de multiplicare contaminarea fiind zero, iar varianta cu 0,0050 % bioxid de clor a dat rezultate optime privind rata de multiplicare. Roboţii sunt utilizaţi în prezent la firma Vitroplus pentru manipularea plantulelor de ferigă. Robotul de tip Pic-o-Mat se foloseşte pentru transferul din faza de multiplicare în faza de înrădăcinare in vitro în cadrul tehnologiilor Vitrotray şi Vitroplug sau pentru transferul ex vitro în faza de aclimatizare.
Cercetări cu o deosebită importanţă practică pentru micropropagare, vizând utilizarea unor agenţi de gelificare alternativi, sunt legate de numele cercetătorilor indieni Shashi Babbar şi Ruchi Jain (Jain şi Babbar 2002, 2011), ei obținând rezultate foarte bune cu produsul Isubgol (tărâţe de Psyllium) şi guma guar la specia de orhidee Dendrobium chrysotoxum.
Unii cercetători au testat tehnici noi, neobişnuite, de aclimatizare ex vitro. La Curcuma longa s-a realizat aclimatizarea ex vitro în vase cu soluţie hidroponică Hoagland, umiditatea aerului fiind menţinută la valori ridicate (Zapata şi colab., 2003).
La SCDP Cluj au fost elaborate mai multe tehnici de aclimatizare noi, radical diferite prin faptul că nu necesită aer cu umiditate ridicată. Una din noile metode se bazează pe cultura plantelor în vase cu apă (Fira şi Clapa 2009) alta se bazează pe cultura plantulelor în plăci alveolare puse să plutească pe suprafaţa unor minibazine cu apă, iar a treia constă în cultura lăstarilor neînrădăcinaţi sau a plantulelor înrădăcinate, într-un strat de perlit care pluteşte pe suprafaţa apei din bazin (Clapa şi colab., 2013).

2.4. Importanta practică, avantajele şi dezavantajele micropropagării Importanţa micropropagării şi principalele sale avantaje comparativ cu multiplicarea
vegetativă clasică sunt (după Cachiţă - Cosma, 1987; Stănică şi colab., 2002) :

- Posibilitatea de a obţine plante libere de agenţi patogeni, în special viroze, prin culturi de meristeme;
- Eficacitatea şi productivitatea imensă, inegalabilă în prezent, datorită ratelor de
multiplicare imense, în progresie geometrică, în mai multe cicluri pe an;
- Potenţialul rol în ameliorarea plantelor, datorită faptului că o selecţie valoroasă poate fi multiplicată extrem de rapid şi introdusă în cultura la scară mare;
- Nu este dependentă de anotimp şi de intemperii, datorită faptului că se realizează în incinte cu climat controlat;
- Se face economie de spaţiu;
- Oferă posibilitatea conservării unor genotipuri valoroase în spaţii mici;
- Uşurinţa transportului unei cantităţi mari de germoplasmă independent de măsurile de carantină fitosanitară;
- Oferă posibilitatea multiplicării eficiente la unele specii la care multiplicarea prin metode tradiţionale este dificilă sau neeconomică;
- Oferă o posibilitate reală pentru a salva şi înmulţi specii de plante rare.

Micropropagarea are şi unele dezavantaje:

- Este mai complicată şi mai sofisticată decât metodele tradiţionale şi necesită pregătire specială;
- Costurile iniţiale pentru realizarea unei unităţi de micropropagare sunt relativ mari;
- Este nevoie de aparatură, utilaje şi echipamente speciale, precum şi de substanţe chimice costisitoare şi de puritate ridicată;
- Există pericolul invadării pieţei cu soiuri şi specii care sunt “la modă” sau care sunt uşor de înmulţit in vitro, în detrimentul altor specii şi soiuri.

În afară de acestea, micropropagarea prezintă toate avantajele şi dezavantajele producerii de material săditor containerizat, deoarece în marea majoritate a cazurilor produsul final, plantele înmulţite prin micropropagare se prezintă ca şi material săditor containerizat (plantat la ghiveci).

Acestea sunt (după Stănică şi colab., 2002):

- Tehnicile culturale permit mecanizarea şi standardizarea lucrărilor;
- Plantele sunt mai uşor de manevrat comparativ cu cele cultivate în solul din câmp, nu trebuie scoase din pământ cu ocazia transplantării sau livrării;
- Plantele containerizate pot fi transportate, vândute, livrate şi plantate pe tot parcursul anului, cu excepţia perioadelor foarte reci sau foarte calde;
- Valorificarea mai bună a terenului datorită densităţii foarte mari a plantelor pe unitatea de suprafaţă;
- Rădăcinile plantelor containerizate sunt bine dezvoltate, formând o reţea relativ densă în balotul de pământ din container, ceea ce asigură un procent foarte mare de prindere, de aproape 100 %;
- Se elimină necesitatea stratificării sau a depozitării în condiţii speciale, prin stratificare sau îngropare.

....

III. MATERIAL ŞI METODE DE CERCETARE

Acest capitol, prin cele şapte subcapitole ale sale, descrie speciile şi soiurile studiate, condiţiile de cultură, procedurile generale din etapele de micropropagare comune celor cinci specii precum şi procedurile specifice pentru fiecare specie în parte în fazele de inţiere a culturilor in vitro, stabilizarea culturilor in vitro, multiplicarea, înrădăcinarea şi aclimatizarea.

Experimentele s-au desfăşurat în perioada 2010-2013 în cadrul Laboratorului de culturi in vitro al Staţiunii de Cercetare Dezvoltare pentru Pomicultură Cluj. Materialul biologic investigat este reprezentat de 6 soiuri din 5 specii de arbuşti fructiferi după cum urmează:

· Amelanchier canadensis – Fam. Rosaceae - soiul Rainbow Pillar.
· Lonicera kamtschatica – Fam. Caprifoliaceae - soiurile Duet şi Atut
· Lycium barbarum – Fam. Solanaceae - soiul Ning Xia N1.
· Rubus fruticosus – Fam. Rosaceae - soiul Loch Ness
· Vaccinium macrocarpon – Fam. Ericaceae - soiul Pilgrim.

3.2.Proceduri generale comune utilizate pentru toate speciile studiate

Mediile nutritive utilizate au fost mediul Murashige & Skoog 1962 (MS) modificat (Tabelul 1) pentru Amelanchier canadensis, Lonicera kamtschatica, Lycium barbarum şi Rubus fruticosus şi Woody Plant Medium, după Lloyd şi McCown (WPM) modificat. pentru
Vaccinium macrocarpon (Tabelul 2).

tabel1.jpg
tabel1.jpg (86.18 KiB) Viewed 30753 times



Tipul de vas utilizat pentru iniţierile de culturi in vitro: eprubete de sticlă, cu cca 5 ml mediu. Pentru toate speciile, în faza de iniţiere şi stabilizare a culturilor in vitro mediile de cultură au fost gelificate cu agar care, datorită transparenţei, permite observarea infecţiilor.

Metoda de dezinfecţie a materialului vegetal: clătirea cu amestec de 20 % înălbitor ACE cu apă deionizată sterilă, urmată de minimum 4 spălări.
Pentru faza de multiplicare la toate speciile au fost utilizate borcane cu capac cu filet, prevăzut cu filtru antibacterian.
Metodele de aclimatizare utilizate cu precădere la toate speciile luate în studiu au fost cele două metode elaborate la SCDP Cluj: metoda hidroculturii prin flotaţie şi metoda aclimatizării în perlit flotant.

Analiza statistică. Pentru analiza statistică a datelor s-a utilizat ANOVA monofactorial (p≤0.05). Programul utilizat a fost Gnumeric (produs de The Gnome Foundation). Barele de eroare din grafice reprezintǍ erorile standard, iar a, b, c, d indicǎ semnificaţia statisticǎ a diferenţelor dintre variantele experimentale. În vederea elaborării unor protocoale eficiente pentru fiecare specie au fost stabilite metodele de cercetare şi variantele experimentale pentru fiecare fază a micropropagării (faza de initiere şi stabilizarea culturilor, faza de multiplicare şi faza de inrădăcinare şi aclimatizare).

REZULTATE ŞI DISCUŢII

.....

VI. ÎNMULŢIREA IN VITRO A SPECIEI LYCIUM BARBARUM

6.1. Iniţierea şi stabilizarea culturilor in vitro

În cazul iniţierii de culturi in vitro prin germinarea aseptică a seminţelor de goji din soiul Ning Xia N1 procentul de germinaţie in vitro al seminţelor a fost de 50 %. Nu s-au observat contaminări. Plantulele au crescut 5-8 cm într-o lună.

La materialul vegetal obţinut în faza de iniţiere, subcultivat pe mediul MSa fără hormoni explantele conţinând mugurele apical au crescut generând plantule bine înrădăcinate, cu lungimea de până la 10 cm, în timp ce minibutaşii constând din fragmente nodale de 2-3 noduri au generat plantule mai slab dezvoltate, cu lăstari scurţi (de 1-3 cm), roşiatice. Pe mediile MSs fără hormoni, din fiecare minibutaş (cu sau fără mugure apical) a crescut câte un lăstar principal
de peste 10 cm lungime şi 1-5 lăstari secundari mai scurţi. Rata medie de proliferare a fost de 3,95, iar procentul de înrădăcinare a fost de 100 %. Datorită calităţii lor, plantulele cultivate pe MSs fără hormoni au fost ulterior utilizate pentru înfiinţarea de experimente de multiplicare in
vitro.

6.2. Multiplicarea in vitro

Rezultatele obţinute în urma experimentelor de multiplicare la L. barbarum arată că amidonul de grâu ca şi agent de gelificare a avut un rol hotărâtor pentru succesul fazei de multiplicare in vitro. Concentraţia de 0.3 mg/l BAP s-a dovedit a fi optimă pentru această fază, asigurând rate de multiplicare şi de proliferare mari şi lăstari bine dezvoltaţi, explantele optime fiind minibutaşii cu 4 noduri (Fig. 6). V1, V2, V3 reprezintă variantele cu minibutaşi cu două
noduri, respectiv MSs + 0,1 mg/l BAP ; MSs +0,3 mg/l BAP ; MSs +0,5 mg/l BAP. V1`, V2`şi V3` reprezintă variantele cu minibutaşi cu 4 noduri, respectiv: MSs + 0,1 mg/l BAP ; MSs +0,3 mg/l BAP ; MSs +0,5 mg/l BAP. Explantele inserate vertical în masa de mediu nutritiv au determinat proliferare mai intensă decât cele plasate orizontal pe suprafaţa mediului (Tabelul 7).

Ca şi explante pentru noi cicluri de multiplicare cele mai bune rezultate le-au dat lăstarii sau fragmentele de lăstari de 2 cm (4 inoculi/vas de cultură) sau lăstari de 4 cm lungime (2 inoculi/vas de cultură). Aceştia din urmă pot fi inoculaţi în diverse moduri în mediul nutritiv, dând rezultate bune în toate variantele utilizate: plasaţi orizontal pe suprafaţa mediului, inseraţi oblic în mediu, inseraţi vertical în mediu. Fig. 7 prezintă plantule regenerate din lăstari lungi.


alexgraph.jpg
alexgraph.jpg (56.04 KiB) Viewed 30753 times

Fig. 6. Influenţa diverselor concentraţii de BAP asupra proliferării şi multiplicării in vitro la Lycium barbarum, la seriile experimentale cu cele două tipuri de minibutaşi: A - minibutaşi cu două noduri; B - minibutaşi cu 4 noduri; ciclul de multiplicare a fost de 2 luni V1, V2, V3 - minibutaşi cu două noduri, respectiv MSs + 0,1 mg/l BAP; MSs + 0,3 mg/l BAP ; MSs + 0,5 mg/l BAP; V1`, V2`, V3`, minibutaşi cu 4 noduri, respectiv: MSs + 0,1 mg/l BAP ; MSs + 0,3 mg/l BAP; MSs + 0,5 mg/l BAP



tabel7.jpg
tabel7.jpg (85.24 KiB) Viewed 30753 times
User avatar
bernard
Administrator
Administrator
 
Posts: 1273
Images: 13
Joined: Mon Feb 17, 2014 1:42 am
Cash on hand: 22,687.67
Bank: 1,311.13

WARNING

This thread has 3 replies

You must be a registered member and/or logged in to view this response.


Register or Login

 

Membrii inregistrati, va rugam sa folositi butonul POSTREPLY (RASPUNS) de mai sus, pentru a adauga un raspuns, pentru ca acesta este salvat in baza de date a forumului si astfel textele vor fi incluse in cautari la Search, Posturi Recente, etc. si face urmarirea posturilor si raspunsurilor mult mai usoara, deoarece sunt deja categorizate pe baza topicelor, pe cand comment-urile Facebook se pot cauta numai pe FB.. Multumim!

Vizitatori, ce nu au un cont inregistrat, folositi comment-urile Facebook de mai jos, dar recomandam sa va inregistrati si sa deveniti un membru al comunitatii noastre !

 

leave a comment

Return to Despre Planta Goji - About the Goji Plant

Who is online

Registered users: No registered users

Googlepage: GooglePullerPage
cron